کیت رنگ آمیزی گرم

رنگ آمیزی گرم چیست؟

رنگ آمیزی گرم یک تکنیک رایج است که برای افتراق دو گروه بزرگ باکتری بر اساس اجزای مختلف دیواره سلولی آنها استفاده می شود. روش رنگ آمیزی گرم با رنگ آمیزی این سلول ها به رنگ قرمز یا بنفش، بین گروه های گرم مثبت و گرم منفی متمایز می شود. باکتری های گرم مثبت به دلیل وجود لایه ای ضخیم از پپتیدوگلیکان در دیواره سلولی خود، بنفشه را رنگ می کنند که کریستالی بنفش رنگ شده این سلول ها را حفظ می کند. روش دیگر، باکتری‌های گرم منفی قرمز رنگ می‌شوند که به دیواره نازک‌تر پپتیدوگلیکان نسبت داده می‌شود که کریستال بنفش را در طول فرآیند رنگ‌زدایی حفظ نمی‌کند.

رنگ آمیزی گرم چگونه کار می کند؟

رنگ‌آمیزی گرم شامل سه فرآیند می‌شود: رنگ‌آمیزی با رنگ محلول در آب به نام کریستال ویولت، رنگ‌زدایی و رنگ‌آمیزی متقابل، معمولاً با سافانین. به دلیل تفاوت در ضخامت یک لایه پپتیدوگلیکان در غشای سلولی بین باکتری های گرم مثبت و گرم منفی، باکتری های گرم مثبت (با یک لایه پپتیدوگلیکان ضخیم تر) لکه کریستال بنفش را در طول فرآیند رنگ زدایی حفظ می کنند، در حالی که باکتری های گرم منفی رنگ بنفش کریستالی را از دست می دهند. و در عوض در فرآیند رنگ آمیزی نهایی توسط سافرانین رنگ آمیزی می شوند. این فرآیند شامل سه مرحله است:

1. سلول ها با رنگ بنفش کریستالی رنگ آمیزی می شوند. در مرحله بعد، یک محلول ید گرم (ید و یدید پتاسیم) اضافه می شود تا یک کمپلکس بین کریستال ویولت و ید ایجاد شود. این کمپلکس مولکولی بزرگتر از لکه و ید کریستال بنفش اصلی است و در آب نامحلول است.
2. رنگ‌زدایی مانند اتیل الکل یا استون به نمونه اضافه می‌شود که لایه پپتیدوگلیکان را خشک می‌کند و آن را منقبض و سفت می‌کند. کمپلکس بزرگ کریستالی بنفش-ید قادر به نفوذ به این لایه پپتیدوگلیکان سفت شده نیست و بنابراین در سلول در باکتری های گرم مثبت به دام می افتد. برعکس، غشای خارجی باکتری های گرم منفی تخریب می شود و لایه نازک پپتیدوگلیکان سلول های گرم منفی قادر به حفظ کمپلکس کریستالی بنفش-ید نیست و رنگ از بین می رود.
3. یک ضد لکه مانند سافرانین با محلول ضعیف در آب به نمونه اضافه می شود و آن را قرمز رنگ می کند. از آنجایی که سافرانین از بنفش کریستالی سبک تر است، رنگ بنفش را در سلول های گرم مثبت مختل نمی کند. با این حال، سلول های گرم منفی رنگ شده قرمز رنگ می شوند.

نحوه رنگ آمیزی :

معرف ها:

• کریستال ویولت (لکه اولیه)
• محلول ید/ Gram’s Iodine (ماده ای که کریستال بنفش را به دیواره سلولی تثبیت می کند)
• رنگ زدا (مثلا اتانول)
• سافرانین (لکه ثانویه)
• آب (ترجیحا در یک بطری آبپاش)

نحوه آزمایش

1. یک لام از نمونه سلولی برای رنگ آمیزی درست کنید. با گذراندن لام با یک قطره یا تکه کوچک نمونه روی آن سه بار، نمونه را به لام روی لام ثابت کنید.
2. لکه اولیه (بنفش کریستالی) را به نمونه/لام اضافه کنید و به مدت 1 دقیقه انکوبه کنید. اسلاید را با جریان ملایم آب حداکثر به مدت 5 ثانیه بشویید تا کریستال بنفش چسبانده نشده پاک شود.
3. ید گرم را به مدت 1 دقیقه اضافه کنید – این ماده خشک کننده یا عاملی است که کریستال بنفش را به دیواره سلولی باکتری ثابت می کند.
4. نمونه/اسلاید را با استون یا الکل به مدت 3 ثانیه بشویید و با جریان ملایم آب بشویید . الکل در صورت گرم منفی بودن نمونه را بی رنگ می کند و کریستال بنفش را از بین می برد. با این حال، اگر الکل برای مدت طولانی روی نمونه باقی بماند، ممکن است سلول های گرم مثبت را نیز بی رنگ کند .
5. لکه ثانویه سافرانین را به لام اضافه کنید و به مدت 1 دقیقه در انکوباتور قرار دهید. با جریان ملایم آب حداکثر به مدت 5 ثانیه بشویید. اگر باکتری گرم مثبت باشد، لکه اولیه (بنفش کریستالی) را حفظ می کند و لکه ثانویه (سافرانین) را نمی گیرد و باعث می شود زیر میکروسکوپ بنفش/بنفش به نظر برسد. اگر باکتری گرم منفی باشد، لکه اولیه را از دست می دهد و لکه ثانویه را می گیرد و در زیر میکروسکوپ قرمز به نظر می رسد.